利用NCBI设计引物

NCBI(National Center for Biotechnology Information )全称:美国国家生物技术中心网。可以在其中查找基因组、基因、蛋白,还可以在其中进行文献查找(Pubmed)、序列比对(Blast)等操作,甚至还可以在线设计引物。

并且,基于NCBI庞大的数据库信息,可以实现对引物扩增特异性的预测,甚至直接设计出特异性良好的qPCR引物(预测值)。

引物设计链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

打开网站,我们看到是这样的界面

它包含四个参数:

  1. PCR Template PCR模板
  2. Primer Parameters引物参数
  3. Exon/intron selection外显子/内含子选择
  4. Primer Pair Specificity Checking Parameters引物对特异性检测参数

① PCR Template

我们直接输入我们想要进行引物设计的序列 accession, gi, 或者FASTA格式序列即可。

② Primer Parameters

第一行和第二行是对已有的引物进行特异性检验,留空就行。

我们可以设置PCR产物大小,返回引物引物数量(默认是10条),和引物的Tm值。对于qPCR来讲,默认的即为最佳Tm值60°C,不需做任何修改。

③ Exon/intron selection

在Primer Design Tool中,我们可以进行跨外显子设置,该设置有三个不同的选项,分别代表:对跨外显子无要求、一对引物中至少一条一定要跨外显子以及引物可以不跨外显子。

要注意,选择后两项时,PCR模板栏中必须要填写NCBI中序列的登录号,如mRNA的NM号,以便于程序识别其中的外显子拼接位点。如果手动粘贴序列,则会因为无法定位外显子而设计失败。

Exon junction span一栏的下方可以对引物跨外显子的其他参数进行调整,如跨外显子引物在前后两个外显子的配对碱基数、内含子长度、扩增产物是否允许在统一外显子上等。

④ Primer Pair Specificity Checking Parameters

良好的引物特异性能够保证在PCR过程中只扩增出目的基因的片段,而不会出现非特异性结合与扩增产物。

首先我们需要确保Specificity check一栏中已经打勾。Search mode一般选择Automatic即可,这样当用户输入的模板在比对的数据库中有很多相似的序列时(比如一段DNA序列在多个转录变体中都有),用户可以选择哪一些是需要检测的PCR模板。

Database是指特异性检测所用到的数据库:一般选择Refseq mRNA。

Exclusion行中,可以对预测的序列以及环境/不可培养样本序列的干扰。

Organism是指样本所属物种,将物种名称如:Homo sapiens(或直接human)输入,选择候选栏中对应的物种即可。也可以直接输入物种ID (常用的如:人9606,小鼠10090,大鼠10114)。

在Organism下方,可以对特异性要求的严格程度进行设置,比如引物对非特异结合位置至少要有几个不匹配碱基等。在Splice variant handling一栏中,我们可以勾选上,使得引物由“转录本特异”变为“基因特异”,即能与该基因的多个转录变体结合。但需要注意的是,该选项只能保证设计出的引物可以结合多个转录变体,但并不能保证所有的转录变体都能检测到。

⑤ 高级参数设置

在Advanced parameters中,我们可以进一步对引物的参数信息进行调整,如特异性检测参数、引物长度、GC含量范围等等。其中比较常用到的是最后一项:内部杂交寡核苷酸(Internal hybridization oligo),可以在此进行Taqman探针的设计。

虽然上面罗嗦了这么多,但实际上大多参数在Primer designing tool中已经预设好了,无需做任何改动。绝大多数情况下,我们只需要调整PCR产物大小、引物Tm值、物种等参数即可。参数设置结束之后,点击“Get Primers”,即可等待结果的出现了。


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